由于体内微环境的复杂性以及参与天然组织发育和维持的各种因素，构建功能性骨骼肌组织是一项持续的挑战。然而国内十大期货配资公司，随着对体内天然骨骼肌微环境理解的不断加深，以及在体外成功复制这些因素的能力的提高，正在促进具有更高仿生结构和功能的工程化骨骼肌组织 (SMT) 的形成。本综述首先概述了骨骼肌组织的结构，然后探讨了各种水凝胶、生物材料和支架作为复杂骨骼肌结构构建块的作用。此外，本文还探讨了在体外培养过程中可施加的外部刺激和调节剂在形成功能性更强的SMT模型方面的作用。这些刺激包括各种物理、生化、电、机械和磁刺激，以及通过与成纤维细胞、内皮细胞或神经元细胞共培养而产生的生物刺激。最后，讨论了最近开发的用于体外和体内应用的功能组织模型的例子以及该领域的未来前景。

一、引言

骨骼肌组织工程是一个专注于在体外开发工程化骨骼肌组织（SMTs）的研究领域。近年来，该领域通过摒弃传统的二维培养皿，逐步引入新的参数以重现天然组织的微环境，取得了显著进展。这些进展使得研究人员能够识别出多种与骨骼肌微环境相关的生化因素，这些因素能够指导特定的细胞行为，如靶向细胞生长、分化和成熟。为了有效引导细胞行为和组织形成，研究人员采用了多种参数，包括所使用的细胞类型、生物材料的特性、细胞培养基底的拓扑结构以及刺激方法。此外，上述参数的组合可以协同促进复杂骨骼肌模型的形成。本综述将首先总结骨骼肌的组织结构，描述其自然成熟过程，并阐明体外工程化SMT的重要性。接下来，将回顾用于实现骨骼肌组织工程的技术，从一维到四维，并比较工程化SMT的成熟度和功能性。最后，我们将讨论在当代SMT工程中突出的多种外部刺激和调节因子的影响，并描述它们如何影响组织模型的形成、成熟和功能。

二、骨骼肌组织

骨骼肌组织是解剖学和生理学传统上联合教学的一个典型例子；骨骼肌组织的形态对其器官功能至关重要。这种结构的任何损伤都会立即对肌肉系统的功能产生不利影响。为了理解如何开发功能性SMT，了解骨骼肌在体内是如何形成和调节的非常重要，包括身体自然修复受损或病变肌肉的尝试为何往往无法恢复功能性肌肉组织。

2.1 骨骼肌组织的结构

骨骼肌组织具有高度有序的层次结构。这种结构的最高层次是肌肉本身，它由多个肌束（fascicles）组成，这些肌束被包裹在一层结缔组织鞘（外膜）中。每个肌束本身又是一束肌纤维，也称为肌原纤维。单个肌原纤维是一个长的多核肌细胞；正是这种肌细胞结构赋予了骨骼肌组织沿单一轴向收缩的能力。肌束的这种束状结构使得肌原纤维能够平行排列在单一方向上，从而最大化其收缩强度（图1A）。

图1.骨骼肌组织的结构和发育。A）骨骼肌的层次结构，其中肌纤维被捆绑成越来越大的肌束，为骨骼肌的特定功能提供了各向同性的形态。B）卫星细胞的特化为肌原细胞，其特征是成对盒蛋白5（Pax5）和成对盒蛋白7（Pax7）的出现。这些细胞从肌原细胞分化为肌管的特征是Myf5、MyoD和Myogenin。最后，成熟的肌原纤维通过表达MHC和Mrf4被表征为完全功能化。

重要的是，分化的成年肌原纤维无法进行有丝分裂。任何因损伤或疾病而丢失的肌原纤维必须通过一种前体细胞——肌原细胞来替代。每根肌原纤维周围都有一个支持性支架结构，称为基底膜。在基底膜内，有一群祖细胞，即卫星细胞，它们通过增殖和随后的分化维持肌原细胞群体。卫星细胞是身体肌肉维护系统的主要组成部分，经常被激活以替代丢失的肌原纤维。肌原细胞是单核细胞，在适当的外部刺激下，会通过与其他肌原细胞融合，最终形成单个、多核的肌原纤维（图1B）。在修复过程中，卫星细胞衍生的肌原细胞通常通过与现存的次级肌原纤维融合而分化，从而增加其大小并恢复组织的丢失功能。通过这一过程，身体能够在一段时间内维持和调节骨骼肌的大小和形状。

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肌原纤维的功能能力来源于内部结构中的特定蛋白质群体。这些蛋白质在肌细胞内形成长的平行纤维，其中重复的功能单元称为肌节，沿着这些带状结构排列。每个肌节以称为Z盘的蛋白质带开始和结束。在每个Z盘之间，由肌动蛋白组成的细丝排列形成一种类似骨架的结构，围绕着由肌球蛋白组成的粗丝核心。当肌球蛋白和肌动蛋白结合时，细丝被拖过粗丝，肌节本身发生收缩。这些最小的动作构成了骨骼肌关键功能的基础。

肌原纤维利用机械转导途径来调节其功能特性。肌细胞能够通过一种称为整合素的跨膜蛋白检测其环境中的机械信号。整合素形成了细胞内细胞骨架和细胞外基质（ECM）之间的连接点。机械转导是将机械信号（如基质刚度或剪切应力）转化为细胞的化学反应的过程。整合素可以聚集在一起形成复杂的跨膜束，称为黏着斑。这些复合体对于外部机械刺激的放大和下游信号传导至关重要。它们直接影响肌动蛋白细胞骨架的重塑，从而影响肌原纤维的机械特性和行为。近年来，科学家们已经成功地绘制了机械转导途径。这些途径以及类似的其他刺激形式（如电刺激或化学刺激）所衍生的途径，导致几种蛋白质的表达和激活增加，这些蛋白质在调节功能性肌肉组织的形成以及肌钙蛋白（MHC）从一种亚型向另一种亚型的转化中具有特定的重要性。在本综述中，将详细讨论其他刺激的影响。

2.2 肌肉表型的发育

骨骼肌在结构上相似，但在大小和力量上差异很大。它们的大小和力量是重要的表型特征，但在同一个体中它们的解剖学差异如何解释？答案在于肌节中的蛋白质，这些蛋白质决定了其功能特性。定义肌原纤维的结构和功能表型的最重要的蛋白质之一是肌球蛋白。在结构上，肌球蛋白有两个球状头部单元，其尾部以α-螺旋结构相互缠绕。一个头部单元及其单个尾部称为肌球蛋白重链（MHC）。MHC存在多种亚型或版本，对应于几种不同的肌原纤维表型，这些表型出现在肌肉生长和发育的不同阶段。例如，MHC-emb和MHC-neo分别出现在胚胎期和新生儿期。而m-MHC仅出现在下颌区域，心肌α-MHC主要存在于心肌细胞中。在骨骼肌细胞中，MHC亚型可以通过其独特的ATP酶活性来表征，这反过来又影响其他下游表型特征，如收缩速度和抗疲劳能力。每种亚型在决定肌原纤维的代谢活性方面都至关重要，这也影响了肌细胞本身的收缩行为。

在肌肉形成过程中，MHC亚型的存在非常重要。某些亚型仅出现在生命的特定阶段。MHC-emb是胚胎期肌肉形成阶段的主要MHC蛋白。在这个阶段，胚胎肌原细胞通过融合形成初级肌原纤维。这些肌原纤维比成年肌原纤维小，因为它们是由早期肌肉形成阶段的较少数量的肌原细胞组成的。有人认为，初级肌原纤维的存在是为了为身体构建肌肉模式。在肌肉模式建立后，发生胎儿/新生儿肌生成。新生儿肌原细胞通过与初级肌原纤维直接融合而分化，形成次级肌原纤维。次级肌原纤维遵循初级肌原纤维的形状和肌肉模式，但由于核数量更多，其纤维直径明显更大，收缩力能力也更强。在发育的第一个月，这些肌原纤维主要表达MHC-neo，MHC-emb的表达量相对较小。然而，肌原纤维迅速生长，功能强度增加，MHC亚型也随之转变为与成年肌原纤维相关的亚型。

成年肌原纤维的肌节中含有不同比例的MHC亚型，这取决于肌肉的位置以及其受到的各种外部刺激。成年骨骼肌中最常见的MHC亚型是慢速类型I、快速类型IIa、快速类型IIb和快速类型IIx。每种MHC亚型的功能略有不同；主要包含慢速类型I亚型的肌肉被分类为“慢肌纤维”，通常具有抗疲劳性。主要包含类型IIx和类型IIb亚型的肌肉被分类为“快肌纤维”，因为它们收缩速度快，且具有糖酵解代谢途径。这些蛋白质水平上的表型差异创造了功能和结构不同的成年肌原纤维，从而影响了组织本身的表型。研究人员已经开始通过测量肌节中MHC的组成来确定肌原纤维的表型，这种方法既适用于从患者体内取出的组织，也适用于体外培养的组织。

2.3 肌原细胞分化的标志物

有几种肌原调节因子（MRFs）对于肌原细胞的适当增殖和分化为肌原纤维至关重要。这四种关键的MRFs被称为Myf5、MyoD、Mrf4和Myogenin。它们是主要参与肌生成转录调控的蛋白质。通过分析体内或体外肌原细胞或肌原纤维群中这些蛋白质的存在，研究人员能够确定细胞是否表达与成熟、功能性肌原纤维相关的MRFs。例如，Myf5和MyoD由未分化的肌原细胞在融合前表达，而Myogenin在功能性肌原纤维中显著上调。MyoD和Myf5在分化后不再表达，因为它们部分用于细胞周期调控，这对于已经分化的肌原纤维是不必要的。Myogenin和Mrf4分别表明肌原细胞成功融合为肌管和肌原纤维的形成，而肌原纤维的进一步成熟则通过MHC的存在来确认。

骨骼肌组织的自然调控途径的复杂性不容小觑；存在广泛的环境线索，这些线索上调和下调特定基因，以编织出由不同比例的MHC蛋白组成的有机肌肉“织锦”。所有这些亚型的总和产生了一种最终的混合纤维，其净表型取决于这些亚型的相对比例。这种结构随着身体适应新的负荷模式以及电/激素变化而不断变化，并且在尝试修复因损伤或疾病而丢失的纤维时也是如此。

2.4 疾病和损伤状态

骨骼肌在其一生中可能会遭受多种损伤，从暂时性拉伤（在短时间内降低功能）到更严重的撕裂伤（可能导致肌肉收缩能力永久丧失）。由于运动和体育活动的普及以及平均人一生中可能发生的潜在创伤事件，肌肉损伤相当普遍。在大多数情况下，简单的治疗（包括休息和轻度康复）可以为肌肉组织提供其自然修复所需的环境。然而，与大多数类型的组织损伤一样，可能会出现并发症，需要更协调和直接的干预和治疗方法。

研究人员描述了三类通常需要手术的肌肉组织特定损伤：i）严重的肌肉血肿，ii）骨化性肌炎，iii）筋膜室综合征。前两类在轻度阶段仍可以通过非手术方法治疗，只有在最严重的情况下才需要手术。最后一类，筋膜室综合征，在诊断后需要立即手术以挽救组织。骨骼肌组织在一定程度上可以自我更新，超过这个限度后，受损组织则被非功能性瘢痕组织所替代。功能性肌原纤维的丢失及其被纤维性瘢痕组织替代是体积性肌肉丢失（VML）的一个关键特征。如果肌肉遭受超过20%的体积丢失，则被认为无法通过传统外科手术方法修复。当前的疗法旨在突破20% VML替代的限制，包括复杂的自体肌肉瓣移植和类似的移植，这些方法并不理想，因为它们会诱导供体部位的发病率，以及功能限制。

衰老过程也对骨骼肌的发育和维持产生巨大影响。自然肌肉萎缩（也称为肌肉减少症）在大多数人类50岁以后发生，与肌纤维总数的减少以及纤维直径的减小有关。这些形态学变化导致肌肉总强度降低。随着许多发达国家老年人口的增长，以及肌肉力量在活动能力和生活质量中的关键作用，肌肉修复成为一个越来越迫切需要解决的问题。

不幸的是，肌肉减少症可能会因各种疾病而加剧。例如，癌症患者可能会经历一种称为恶病质的肌肉萎缩的高级形式。受影响肌肉的总体积丢失平均范围为20%到70%，具体取决于癌症的类型和阶段。癌症治疗的一些副作用，例如食物摄入量减少、体力活动减少以及骨骼肌的静息能量消耗（REE）增加，导致这种快速肌肉退化的环境。

总的来说，恶病质占所有癌症相关死亡的20%到30%，目前通过物理治疗进行治疗，同时正在通过有限的药物试验追求更好的治疗方法。杜氏肌营养不良症（DMD）是一种类似致残的疾病，骨骼肌细胞缺乏关键的抗肌萎缩蛋白基因，导致肌肉不断退化和再生，从而引起急性肌肉萎缩。尽管细胞疗法取得了进展，但临床医生可用的资源仍然不足以逆转癌症恶病质和DMD中呈现的许多症状。骨骼肌组织工程因其在体外生产生物学相关肌原纤维的潜力而具有吸引力。然而，骨骼肌组织工程以及在体外开发更成熟和功能性组织仍然是研究人员今天面临的挑战。组织工程师正在努力更多地了解天然和病变调节途径，以便更好地设计促进健康、功能性SMT的干预策略。在下一部分中，我们将从新的视角回顾SMT工程的现状，并基于在自上而下和自下而上组织工程方法中使用的各种培养策略进行回顾（图2）。

图2.骨骼肌组织工程的进展——从传统到功能性方法。传统组织工程方法是将生物材料、细胞和生长因子等成分组合在一起。然而，这三个主要成分需要与调节因子或外部刺激相结合，以使工程化的SMT具有更接近生物的特性。

三、骨骼肌组织工程

为了开发具有类似天然组织的结构和功能的骨骼肌，已经引入了各种组织工程策略。在组织工程中，模仿细胞外基质（ECM）是目前通过各种方法解决的主要挑战之一。在1959年由费曼提出的传统“自上而下”方法中，使用工具可以在不同尺度上雕刻物体，例如光刻技术。后来，德雷克斯勒引入了一种名为“自下而上”的纳米制造方法，该方法专注于从微尺度构建块构建组织结构。大多数涉及在模具中生产支架的再生医学示例都是自上而下的策略示例；在这里，支架用于促进肌细胞的预排列，同时促进肌原纤维分化后肌细胞融合后的各向异性取向。虽然可以在损伤部位注射肌细胞或将空白支架移植，但移植细胞负载的支架是一种更有希望的策略。与直接将细胞注射到损伤部位相比，软载体可用于局部递送细胞，或使用细胞包埋支架作为替代方案，以提高细胞在损伤部位的递送效率。理想情况下，支架应模仿天然ECM，具有适当的生物物理和生化线索。在自下而上的方法中，构建的形成依赖于从微小模块和组件的自组装或定向组装，具有微尺度精度；这使得构建可以被设计来执行特定任务。在这种情况下，有可能制造出模仿目标组织结构的复杂结构。为了制造这些微尺度建筑单元，不使用生物材料或细胞，已经采用了各种技术，例如细胞片的开发、细胞和细胞聚集体的自组装、微凝胶、微制造的细胞包埋水凝胶和3D生物打印。与其他任何工程过程一样，通过首先比较和对比每个维度在天然骨骼肌结构中的作用，最容易描述3D支架背后的想法。

3.1 一维和二维工程化肌肉组织

肌纤维的单向排列是肌肉组织结构的一个基本特征，始终是模仿该结构功能的首要关注点。因此，将单个短纤维和长纤维视为一维系统，在纤维轴向诱导的细胞拓扑结构的影响下，有效地启动了必要的排列。使用短片段形式的可注射丝带，我们展示了细胞负载的、一维丝带可以有效地支持小鼠肌肉细胞的附着及其随后的分化，引导形成长度约为400微米的长肌管。它们是使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为短长度丝带制造的，具有超薄厚度。与直接注射细胞相比，超薄丝带可以机械地支持预培养在其表面的C2C12细胞。为了评估喷嘴尺寸对丝带可注射性和预加载细胞活性的影响，使用了各种针头规格。通过使用不同针头抽吸和注射细胞来评估细胞活性。我们发现，注射后附着在丝带上的细胞的活性和功能得以保留（图3）。

图3.A）场发射扫描电子显微镜图像显示C2C12细胞在培养2天后附着在丝带上（比例尺：10微米）。B）使用活/死染色评估在PLGA丝带上培养2天的骨骼肌细胞的活性（比例尺：20微米）。C）在自由悬挂的丝带上形成的肌管（比例尺：50微米），显示出清晰的A带（放大图，比例尺：5微米）。

利用微流体技术，我们还微制造了具有微沟槽表面的纤维，以在一维纤维上生成排列的肌肉微组织。采用微流体纺丝方法制造了具有明确定义的微图案的基于明胶甲基丙烯酰（GelMA）的纤维，这些纤维可以与重组agrin的拓扑线索和生化刺激相结合进行研究。与平面光滑纤维相比，微结构纤维显示出C2C12细胞的增强排列以及分化后肌管的形成。基于肌管长度、长宽比和肌生成基因的mRNA表达来评估这些纤维上细胞的肌生成行为，微图案纤维显示出增强的分化肌管形成。此外，我们研究了在分化过程中添加agrin处理的效果，发现其显著增强了乙酰胆碱受体（AChR）和抗肌萎缩蛋白的表达。形成了更多的AChR簇和肌管，这表明拓扑线索和agrin处理的协同效应可以增强所创建肌肉组织的功能性。此外，分化后的肌管在电刺激下显示出高数量的同步收缩（图4）。

图4.A–F）在有无agrin处理的情况下，形成于微图案和光滑GelMA纤维上的肌管显示出不同的长度和长宽比。使用小鼠抗肌球蛋白（MY-32）抗体进行免疫染色（比例尺：50微米）。G）对分化7天后的肌管的排列、H）长度和I）长宽比进行定量分析。

研究人员采用类似的方法，展示了用于智能药物递送、可穿戴或植入式医疗设备以及软体机器人应用的基于水凝胶的纤维的制造和应用，这些纤维具有微尺度形态特征（沟槽、实心和中空）。在沟槽纤维上培养的C2C12肌原细胞显示出改善的排列以及增强和受控的肌生成分化。细胞的形态取决于纤维的沟槽大小（图5A），以及特定的材料组成（图5B）；在光滑纤维上的细胞显示出随机取向，而在沟槽纤维上的细胞则显示出向沟槽方向的增加的方向性排列，这可能是由于沟槽尺寸减小（图5A）。

图5.A）在不同沟槽大小（50到150微米）的光滑和微沟槽纤维上C2C12肌原细胞的排列。B）从明胶和海藻酸盐制成的多组分纤维显示长度和横截面。作为核壳纤维，10%的GelMA用作核，2%的海藻酸盐用作壳，可以在GelMA交联后将其移除。

研究人员还制造了多组分复合纤维，由聚合物芯和涂覆有GelMA/海藻酸盐水凝胶的涂层组成。后来，通过纺织工艺将纤维组装成各种二维和三维结构，以定制组织级特性，并引导细胞在三维微环境中的生长方向。芯纤维由聚二氧六环酮（PDMS）、聚乙醇酸、胶原蛋白和棉制成，并涂覆有细胞包埋的GelMA/海藻酸盐水凝胶混合物。此外，由于导电材料（如石墨烯或碳纳米管）可以影响心肌、骨骼肌和神经组织等电生理响应组织的功能和成熟度，他们使用还原氧化石墨烯（rGO）制造了导电纤维。包埋在涂覆和未涂覆纤维中的C2C12小鼠肌原细胞显示出在纤维方向上的增强粘附、增殖和成熟。然而，包埋在rGO涂覆纤维中的C2C12细胞似乎比其未涂覆的对应物更伸长且更融合。

一维模型（如前所述的单纤维）只能在其表面携带细胞。为了模仿肌肉组织的三维环境，并生长出有效且成熟的组织模型，必须通过多种加工技术以自下而上的方式组装一维构建模块/一维模型。例如，研究人员报道了使用3D打印制造的聚（ε-己内酯）（PCL）基支架。在这种情况下，通过拉伸3D打印的支架形成的单轴取向表面拓扑结构提供了一个二维培养表面平台。将拉伸的PCL纤维与未拉伸的PCL支柱上形成的对齐肌管进行了比较。不出所料，拉伸的PCL纤维显示出更大的肌原细胞排列和更伸长的形态。在培养7天和14天后，使用肌球蛋白染色确定了所有样本上的肌管形成。分析了各种肌肉特异性基因的mRNA表达水平，结果表明，与未拉伸的PCL支柱相比，拉伸-PCL中的Myf5、MyoD、Myogenin和MHC显著增加。在肌生成分化之前，Myf5和MyoD的表达相对较高，因为Myf5与肌原细胞定位相关，而MyoD负责肌肉细胞再生。相比之下，Myogenin和MyHC参与肌原细胞分化为肌管的过程；因此，它们在拉伸PCL上生长的细胞中的表达显著更高。

研究人员展示了胶原蛋白纤维在二维胶原蛋白纤维网络中培养肌原细胞的应用。这些负载细胞的纤维被嵌入到非细胞粘附的琼脂糖水凝胶中，从而显示出更大的肌原细胞排列和增加的分化。通过在收集器上分层纤维，形成了具有控制排列的二维胶原网络。通过改变组装的层数量，或者将纤维嵌入水凝胶中，可以将系统升级为三维网络以培养骨骼肌细胞（图6A）。在3天的培养过程中，C2C12细胞沿着纤维附着并生长，形成类似肌束的结构（图6B）。在嵌入含有胶原蛋白的水凝胶中的纤维上形成了类似肌管的结构，而不是在纯琼脂糖水凝胶中（图6C）。免疫染色证实了在胶原蛋白纤维上生长的大多数排列的骨骼肌细胞表达了分化标志物，如肌球蛋白重链、副肌球蛋白（快收缩骨骼肌纤维中的Ca²⁺结合蛋白）和一氧化氮合酶同工酶（NOS-1）。与在二维培养中的细胞相比，通过西方印迹确认了在3D中（3D（+））和没有（3D（-））纤维的细胞中肌球蛋白重链和副肌球蛋白的表达（图6D）。通过定量聚合酶链反应（qPCR）测量的肌球蛋白重链（E）和副肌球蛋白（F）相对于GAPDH的表达。

还可以通过表面图案化和应用涂层将拓扑线索引入SMT工程系统。微图案化已用于在各种具有平面或弯曲特征的基底上生成简单或复杂的图案（例如，沟槽和脊、柱和孔），并可通过光刻技术应用。它可以指导特定的细胞行为，如肌肉肌原细胞的空间排列和分化。研究人员将这种方法应用于制造微图案化和未图案化的明胶水凝胶，以研究C2C12肌原细胞的排列和分化。在明胶水凝胶中印制的10微米宽的微沟槽中生长的C2C12肌管的肌节形成和肌丝蛋白浓度得到了表征。此外，与在未图案化表面上生长的细胞相比，由排列细胞形成的肌节结构显示出收缩蛋白含量的增加。在那些生长在图案化结构上的细胞中检测到与体内肌肉成熟相关的收缩蛋白发育和基因表达增加（图7）。

图7.免疫荧光图像显示C2C12细胞在A）胶原蛋白涂覆的玻璃B）未图案化的明胶水凝胶C–F）图案化的明胶水凝胶上分化后肌节的形成。G）与其他人相比，图案化表面上肌节形成更多：H）肌节长度I）肌节形成肌管的百分比。

与一维情况类似，微图案化的薄膜或细胞片作为二维培养模型，无法代表天然肌肉组织的真实三维结构；因此，为了在三维环境中为细胞创造更大的灵活性和更高的自由度，可以将细胞片堆叠并组装成多层结构。这种方法由研究人员采用，他们通过微制造和旋涂从PLGA制造纳米丝带，并将它们堆叠在一起，条带之间有间隙。他们发现，这种方法可以将两个或更多的细胞负载结构以各向异性（正交）和各向同性（平行）的方向堆叠在一起，更好地模拟骨骼肌组织的层次结构。他们发现，这种方法显著促进了C2C12细胞在双层细胞片中的排列，并提高了肌肉相关基因的表达，如Myogenin、Mrf4、MHC IIa、MHC IId（x）；该方法还导致了自发收缩，无需刺激。

图6.将胶原网络整合到3D水凝胶支架中以支持细胞排列和肌生成。A）将干织物整合到琼脂糖中。B）荧光图像显示有无织物的构建物中肌动蛋白丝的分布，以促进封装的C2C12细胞的排列。C）共聚焦显微镜图像显示排列的类似肌束结构的细节。C2C12细胞附着在水凝胶内的胶原网络上，显示出分化标志物，如肌球蛋白重链、副肌球蛋白和NOS-I。所有比例尺均为50微米。D）通过西方印迹确认在2D中培养的细胞与在3D中培养的细胞（3D（+））和没有（3D（-））织物的细胞相比，肌球蛋白重链和副肌球蛋白的表达。通过定量聚合酶链反应（qPCR）测量肌球蛋白重链（E）和副肌球蛋白（F）相对于GAPDH的表达。

3.2 三维工程化肌肉组织

大多数骨骼肌的研究使用了如上所述的二维表面结构，这些结构在微/纳米尺度上进行了图案化，以诱导肌原细胞的排列，从而形成肌管。然而，由于缺乏三维结构，它们无法成功地转移到临床应用中。因此，引入并评估了各种更接近天然骨骼肌三维环境的三维培养系统，进一步增加了培养系统的复杂性。在此，我们将简要回顾一些重要的近期工作，以介绍该基底在开发成熟、功能性肌肉微组织方面的潜力。例如，近年来广泛使用了具有各向异性结构的对齐纤维支架，由于其与骨骼肌的各向异性细胞外基质相似，因此是高度成功的潜在基底。它们还可以通过各种高效的加工技术制造，例如静电纺丝。几项研究表明，对齐纤维显著改善了肌细胞的排列及其肌生成反应，同时促进了肌肉组织发育典型基因的上调。

研究人员展示了平行静电纺丝PLGA纤维的直径也对肌细胞的伸长有效。对齐纤维的直径范围从335±154纳米到3013±531纳米，用于表征其与肌原细胞的相互作用。在体外培养过程中，较大的纤维直径显示出增强的排列，并进一步通过p38 MAPK化学途径的磷酸化促进了细胞的分化。此外，重要的肌生成调节因子（MRFs），如Myogenin和肌球蛋白重链的表达上调。在体内研究中，使用优化的纤维支架在mdx小鼠模型（一种抗肌萎缩蛋白缺陷模型）中，支持在胫骨前肌中形成抗肌萎缩蛋白阳性肌原纤维网络。

在确保对齐静电纺丝纤维（由PCL和去细胞-ECM（D-ECM）组成）对体外初级卫星细胞发育的积极影响后，研究人员研究了通过植入这些纤维治疗小鼠模型中的体积性肌肉丢失（VML）。他们之前的体内研究使用D-ECM纤维显示出较差的机械稳定性和快速降解；因此，在本研究中，他们生产了PCL/D-ECM混合物，有效改善了抗炎活性和体内肌原纤维的形成。肌生成蛋白的表达，如MyoD和Myogenin，以及肌因子的产生，都通过对齐的PCL/D-ECM纤维混合物得到了改善。然而，在VML损伤模型中，对肌原纤维生长的质量和力的产生没有影响。

还应用了导电纤维支架来提高肌细胞的肌生成能力。我们展示了通过静电纺丝制造的掺杂有樟脑磺酸（CSA）的明胶-聚苯胺（PANI）复合纳米纤维可以有效地支持C2C12肌原细胞的培养。我们观察到，与非导电的明胶纳米纤维相比，肌管在复合明胶-PANI纳米纤维上的形成得到了改善；这些优势除了能够同时促进肌管的成熟外，还通过分析肌管的细胞内组织和肌节肌动蛋白单位的形成，以及通过表征二氢吡啶受体（DHPR）和兰尼碱受体（RyR）的共定位、肌管收缩性、钙瞬变以及与兴奋-收缩（E-C）耦合装置相关的基因表达，这些都显著增强。直径在300纳米范围内的导电纤维系统有效地结合了拓扑结构和电导率，促进了肌肉组织的成熟（图8）。

图8.在A–D）有和没有CSA和PANI的对齐静电纺丝明胶纳米纤维上，经过6天分化后肌管形成的荧光显微镜图像。E）在分化第4天，肌管结构中显示A带的百分比和F）相位对比图像。

含石墨烯的纤维也显示出类似的肌原细胞分化的改善，展示了基底的微/纳米结构和其电响应特性之间的协同效应。有趣的是，研究人员在完全缺乏分化培养基的情况下，诱导肌细胞在石墨烯复合PCL纤维上分化。所得的石墨烯-PCL支架呈现出改善的机械和物理特性，这些特性可以通过改变石墨烯浓度来调节。它支持C2C12小鼠肌原细胞的粘附和增殖，以及这些细胞在正常生长培养基中的分化，表明了支架的细胞指导潜力。研究人员进一步展示了在由相互连接的微孔碳泡沫和对齐碳纤维垫组成的碳基支架上生长的碳纳米管（CNT）地毯的效果，以研究具有可控物理化学性质的多尺度层次结构。可控的纳米粗糙度和润湿性有助于肌原细胞在CNT地毯表面的粘附、生长和分化。在这种情况下，微孔泡沫结构未能促进它们融合成多核肌管，这可能是由于泡沫结构内缺乏各向异性方向。然而，对齐的纤维结构仍然能够刺激多核肌管的成功形成。

必须指出，尽管碳基纳米材料（如石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯和碳纳米管）可能在体外增强所需的肌细胞功能，但其安全性需要仔细评估。已经进行了大量研究，以研究通过各种方法和起始材料合成的石墨烯基纳米材料的短期和长期体内细胞和生物相容性，以及其致癌潜力。研究人员在最近的一篇综述文章中总结了这些材料的安全性评估，以评估其对人类健康和环境的潜在影响。

由于其固有的可调节物理和化学性质，以及其亲水性、高含水量和允许氧气、营养物质和生物活性分子扩散的结构，水凝胶在类似的组织工程应用中取得了巨大成功。可以通过各种物理和化学交联技术调节其机械性质，如弹性模量，使其更接近天然骨骼肌，以支持成熟骨骼肌的发育。

水凝胶可以源自多种天然、合成或混合材料。研究人员筛选了不同类型水凝胶，以确定其在SMT工程中的适用性。他们研究了I型胶原蛋白、琼脂糖、海藻酸盐、纤维蛋白和胶原蛋白-壳聚糖水凝胶的拉伸机械性质，并研究了它们在14天肌原细胞培养期间体外培养骨骼肌的能力。在所列材料中，I型胶原蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白-壳聚糖水凝胶的平均弹性模量范围为2.7到3.7 MPa，均显示出更好的肌生成结果。然而，非常硬的琼脂糖水凝胶（弹性模量为87.3±32.6 MPa）或非常脆的海藻酸盐水凝胶，由于处理困难，未能促进肌生成。研究人员成功地在体外测试了I型胶原蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白-壳聚糖水凝胶，并发现经过拉伸后，主要的原代大鼠卫星细胞可以在这些水凝胶上被激活并伸长而不会失败。通过其基因RNA表达MHC、MyoD和Myogenin来表征卫星细胞的行为，表明卫星细胞分化并成熟为收缩单位。在14天的培养期间，MyoD的表达减少，而Myogenin的表达在所有五种水凝胶类型中均在第7天达到峰值，然后减少。最终，在第7天和第14天的培养中，只有纤维蛋白显示出显著更高的MHC表达。

研究人员展示了生物人工组织构建物被制成骨骼肌的类器官。它们由能够收缩的对齐肌原纤维组成的肌束构成，能够在电和/或机械刺激下收缩。将各种类型的肌肉细胞（C2C12小鼠肌原细胞、人类肌原细胞或从肌肉活检中分离的人类混合肌肉细胞）与天然人类纤维蛋白水凝胶混合，在含有两个锚点的硅胶模具中，形成这种系统。在培养一周内，细胞-凝胶混合物收缩形成在锚点之间对齐的多核肌管。该系统旨在作为肌肉内药物注射的模型，以减少体内动物实验的需求]。

不幸的是，水凝胶本身无法为封装细胞提供任何拓扑线索，以促进成熟和功能性骨骼肌组织的形成。为了在水凝胶内形成对齐的肌原纤维，要么需要外部拉伸，要么需要各种加工技术；此外，可以使用第二种结构组件作为拓扑线索来修改水凝胶的结构和性质。例如，研究人员发表了一份关于一种创新水凝胶的报告，该水凝胶由具有单轴表面图案的圆柱形支柱组成。明胶基质（肌肉细胞外基质的主要成分，以微图案支柱的形式）和PCL被用来制造这种三维水凝胶，并诱导各向异性细胞排列。聚乙烯醇（PVA）纤维，这里用作牺牲材料，要么与PCL（PVA/PCL溶液（PVA:PCL=3:7））混合，要么与明胶（20%PVA和4%明胶）混合，以制造用于3D打印微图案PCL和明胶支柱的纤维。在打印后，PVA被洗脱，最终获得了具有特定对齐/各向异性表面图案的PCL或明胶支柱。此外，支柱被涂覆有0.5%的明胶，并在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）中浸涂以进行交联。在微图案化的明胶表面上，肌原细胞显示出完全排列以及显著更高的肌管形成水平，与未经过微图案化处理的明胶结构相比。该团队还使用明胶作为生物墨水，结合通过电液动力（EHD）过程制造的三维纤维束结构。制造的支架由负载有肌原细胞的明胶生物墨水的三维微纤维束组成。在拉伸后，纤维变得单轴对齐，以获得完全对齐的三维结构。封装的肌肉细胞后来从明胶生物墨水中释放出来，在支柱上排列并分化为肌管。通过应用对齐的拓扑线索和明胶的高生物相容性的协同组合，显示出良好组织的肌肉组织的生成，并增强了相对表达肌生成基因（Myf5、Myh2、MyoD和Myogenin）（图9）。

图9.细胞负载构建物的示意图和显微镜图像。R-支架指随机排列，A-支架指对齐，C-支架指明胶涂覆。

除了水凝胶增强的纤维或用水凝胶涂层修饰的纤维外，还引入了各种类型的细胞负载纤维结构，作为三维模型以开发工程化SMT。在最近的一项研究中，研究人员展示了从原代肌原细胞或胚胎干细胞衍生的肌原细胞形成的三维结构，作为人类骨骼肌的体外模型，具有类似肌束的形态。该构建物具有单纤维结构，在3D水凝胶内构建的微米级通道中形成。通过调整水凝胶的刚度以匹配天然骨骼肌，成功促进了肌生成。在这种三维培养模型中培养的原代肌原细胞能够分化并成熟为肌管，其特征是表达和定位肌节和肌膜的关键成分。这种结构支持了约10毫米长、约120微米直径的人类肌束的形成。至关重要的是，该结构在培养7天后显示出自发收缩。与原代细胞的二维培养相比，转录组分析显示该系统与天然肌肉组织的相似性更高。此外，该培养模型还促进了胚胎干细胞衍生的肌原细胞的分化（图10）。

图10.A）展示细胞负载微纤维形成人类肌束的示意图。人类原代或胚胎干细胞（ES）衍生的肌原细胞被封装在2D水凝胶支架内的微通道中，在那里它们分化为肌管，形成由周围水凝胶支撑的3D肌束。B）对HOECHST（蓝色）染色的细胞核进行免疫荧光分析，用于desmin（绿色）和抗肌萎缩蛋白（红色），对于MHC（绿色）以及MHC和肌生成素（红色）。

同样，研究人员展示了类似骨骼肌肌原纤维的细胞负载纤维的制造，这些纤维由光交联水凝胶制成，长度达数厘米。可以通过调节曝光时间和水凝胶浓度来调节制造的纤维的机械性质。此外，外部拉伸为更成熟和功能性组织的发展提供了对齐轴。之后，C2C12细胞很好地扩散、伸长，并在单轴拉伸方向上对齐（图11）。

图11.A）展示细胞封装微纤维制造、固定和机械拉伸的示意图。应用的单轴拉伸促进了C2C12细胞的对齐、伸长和分化。B）细胞负载纤维的明场图像（比例尺500微米）。C）在不同应变比下拉伸的微纤维的图像，D）在GelMA水凝胶中微纤维内形成的肌管，E）在不同应变比下拉伸后微纤维的直径变化。

增材制造和3D生物打印技术也通过自下而上的组织工程方法改进了肌肉组织的精确制造。通过制造多层结构，实现了更接近天然结构的生物制造三维构建物。例如，研究人员研究了静电纺丝PCL微/纳米纤维对骨骼肌细胞发育的影响。这些细胞被打印在由PCL支柱加固的海藻酸盐/聚乙二醇醚（PEO）水凝胶中，以获得更高的三维结构。研究人员发现，细胞根据对齐静电纺丝纤维的方向排列。与随机纤维垫以及没有微纤维的示例相比，生长在对齐纤维支架上的细胞显示出更高的肌肉发育相关因子的表达。其他用于机械支持生物制造物的材料还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）。这些材料在细胞培养期间支持打印构建物的形状保真度。

研究人员还展示了熔融电写（MEW）技术在制造具有微尺度沟槽的层次化、各向异性且导电的支架中的应用，这些沟槽位于单向排列的纳米纤维网上。这些微特征支持肌肉祖细胞的接触引导和排列，促进了各向异性且成熟组织的形成。在培养7天后，由于制造的支架中纳米尺度和微尺度各向异性表面拓扑结构的组合，H9c2肌原细胞产生了增加的肌生成反应。分化后的肌管在平行图案化的支架上形成，长度超过600微米，并且显示出更高的肌球蛋白重链（MHC）表达和成熟度指数（2.4倍的MHC表面覆盖率，1.6倍的成熟度指数）。

解决为肌肉细胞重建三维环境的问题是生长和发育功能性肌肉组织的关键，也可以从不同的角度来解决。研究人员报告了应用去细胞化肌肉组织而不是加工聚合物来模仿天然肌肉组织中的层次结构。从人类组织中获得的天然骨骼肌组织经过去细胞化处理，剩余的三维结构中含有胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白，在化学处理组织后对其生物相容性进行了评估。在体外研究中，与成纤维细胞共培养7天确认了支架的生物相容性。为了研究化学去除细胞对天然细胞外基质机械性质的影响，研究人员对从猪体内获得的去细胞化支架进行了拉伸测试。他们报告说，天然组织和处理后的组织之间没有显著差异。研究人员对从猪体内获得的去细胞化支架的内在结构进行了研究。通过扫描电子显微镜（SEM）分析支架，揭示了剩余结缔组织的天然蜂窝结构。植入这种支架已被证明对组织再生有益。

为了进一步改善支架-细胞相互作用，研究人员在去细胞化过程后用胰岛素生长因子（IGF）涂覆去细胞化细胞外基质（D-ECM）。额外的生长因子支持细胞活性，并在培养7天后与D-ECM相比，支持更高量的肌球蛋白重链表达，与胶原蛋白作为对照以及没有额外因子的D-ECM相比。这些发现在兔子的胫骨前肌缺损的体内研究中得到了确认，持续时间为1个月和2个月。植入的移植物在用IGF涂覆时产生了更多的肌原纤维。

总之，去细胞化组织提供了具有相应机械性质的必要结构以及细胞粘附的天然成分。去细胞化天然支架的积极特性可能给人留下进一步研究其他方法的印象，这些方法对于从非天然衍生聚合物制造合成支架是不必要的。但由于天然组织存在批次间差异，标准化从这种组织衍生的支架是困难的。获得的支架的形态不能根据患者的需要进行调整，且不能排除移植的支架因免疫原性而被排斥。因此，研究本综述中描述的其他方法是非常重要的。

3.3 四维工程化肌肉组织

将SMT工程向前推进一步，时间被添加为参数，用于改变肌肉细胞生长的材料的形态。因此，时间的概念被整合到三维结构中，作为第四维度，引入了下一代支架到SMT工程中。4D生物制造技术被用来制造动态和复杂的三维架构，具有特定的几何形状，由刺激响应材料制成，这些材料在暴露于各种刺激后可以发生形状转换。我们最近展示了4D生物制造可以用来增加组织样构建物的复杂性，并精确制造具有层次结构的骨骼肌，例如管状形状。自卷曲双层PCL/甲基丙烯酰化海藻酸盐纤维毡被用作培养肌肉细胞的基底。通过触发双层的膨胀率，它可以发生形状转换，封装C2C12细胞，并形成管状形状。双层的总厚度、每层的厚度以及毡的几何形状是控制卷曲方向和生成管状形状直径的关键参数。在总共14天的培养和7天的分化后，肌原细胞显示出沿各向异性PCL纤维轴的高度排列结构，并进一步分化为收缩性肌管，在电刺激下形成骨骼肌微组织。同样，研究人员报告了一种由两个具有不同膨胀度、刚度和厚度的层堆叠而成的类似肌束的可植入肌肉构建物的制造。由两种不同分子量的PEGDA水凝胶制成的双层能够发生程序化的自我折叠，并形成三维管状形状。在这个构建物中，管的内侧可以引导肌肉细胞的粘附和它们的空间排列。该构建物还被进一步用于测试骨骼肌细胞和人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞。对于这两种类型的细胞都测量了高活性，并且心肌细胞在7天内保持了其收缩功能。

Miao团队使用阶梯缺陷策略创建了四维各向异性骨骼肌组织。阶梯缺陷是由于在3D打印过程中材料逐层沉积的性质，不可避免地出现在熔融沉积建模（FDM）中，因此，构建物的表面呈现出轮廓状拓扑结构。轮廓状拓扑结构由对齐的线条组成，该团队研究了这种定向结构对形成各向异性骨骼肌组织的影响。骨髓来源的人类间充质干细胞的肌生成分化受到这些拓扑结构的影响，表明3D打印PCL可以调节细胞向SMT的行为。表面涂层技术和形状记忆聚合物（如PCL）的结合支持了四维结构的制造。研究表明，这种生物模拟策略支持了高度组织化的功能性SMT的形成，在14天的培养后检测到更高的肌生成基因表达，如肌原细胞分化蛋白-1、desmin和MHC-I。

利用时间在从打印的细胞负载构建物中形成成熟和功能性组织的转换过程中是一种技术，通常也被认为是四维生物打印。不幸的是，这些潜在的干预措施尚未广泛研究其在骨骼肌组织工程中的应用。

对于更严重的损伤，植入完全发育的肌肉组织是完全恢复组织功能的必要条件。仅仅在支架上生长肌肉细胞不足以诱导具有成熟细胞内结构的肌管形成，这些肌管能够产生显著更高的力量。因此，除了前面讨论的生物材料外，还可以部署各种外部刺激来改善肌原细胞的发展；以下部分将广泛回顾涉及这些外部刺激的重要研究。将动态培养系统整合到现有的经典SMT工程方法中，对于改善组织成熟度具有巨大潜力。

四、外部刺激器

坚实的肌肉生理学背景是理解骨骼肌组织如何响应各种外部刺激的关键。肌肉成熟度对这些刺激的敏感性通常归因于肌原纤维的适应能力，其中物理力可以鼓励当前肌肉结构的再生。外部刺激的应用不仅可以激活基因和蛋白质的产生，还可以增强加速生长，从而更快速地促进组织的发展。

当生物材料支持肌肉细胞的自我再生能力并引导它们通过不同的生物途径时，肌肉细胞的增殖效率更高。然而，这种静态系统无法提供适量的营养和生长因子，以加速再生过程。因此，细胞分化前的预排列是关键，因为它促进了适当的分化为功能性肌原纤维，正如前面部分中展示的各种细胞排列方法。骨骼肌具有高度的适应能力；然而，如果它没有得到适当的训练，浪费和虚弱可能会阻碍治疗后的潜在恢复。尽管这对于未得到适当刺激的肌肉来说是一个问题，但肌肉的主要优势在于，即使在长时间未刺激后，训练的好处（如增加的抵抗力）仍然可以诱导。图12总结了用于恢复肌肉组织正常功能损失的不同类型的刺激。在本节中，将回顾各种外部刺激对骨骼肌成熟度和功能的影响。

图12.A）机械刺激，B）电刺激，C）磁刺激，D）化学刺激，E）生物刺激。A）改编自，经许可。版权2019，自然研究。

4.1 机械刺激

在骨骼肌生长的初始阶段，持续加载对组织发育的重要性不容小觑。在胚胎发生过程中，除了决定肌丝的组织外，被动张力在肌丝的形成中起着作用，这些肌丝具有特定的重量、直径和长度。此外，这种拉伸对于维持整个生命周期的健康肌肉至关重要；肌肉拉伸对于肌肉的发育过程尤其关键，由调节特定基因、合成新蛋白质以及释放一氧化氮的调节驱动。施加在肌肉上的机械力通过机械转导转化为化学信号，随后触发卫星细胞的激活。这一过程增加了蛋白质合成的速率，导致更大的肥大和增殖。简而言之，细胞通过各种受体、整合素和黏着斑测量外部机械信号。因此，细胞骨架开始重新排列，将这些机械信号引起的变形转化为可能促进组织成熟的重要因素。骨骼肌由数千个紧密排列在组织中的纤维阵列组成。这种阵列有助于形成更耐受的结构，能够在不轻易破裂的情况下经受重复的拉伸和收缩周期。这些纤维阵列本身由数千个分化的肌原细胞组成。肌管表面的黏着斑接收外部机械线索，从而刺激细胞膜上的各种受体，包括整合素和钙粘蛋白。随后，这些受体的机械刺激激活细胞体内的特定信号通路，根据最初施加刺激的方向重新排列细胞骨架。骨骼肌细胞对机械刺激的响应还取决于体内外组织模型，无论是二维还是三维。

体内的大多数肌原纤维都可以表达所有可用的骨骼肌MHC亚型；每根纤维的具体蛋白质组成由肌原纤维从环境中接收到的刺激决定。例如，研究人员减少了肌肉通常经历的拉伸诱导应变，并观察到某些细胞内调节途径的激活，这导致MHC蛋白从主要的慢型亚型转变为主要的快型。通过这些方法，组织工程师可以直接影响实验室中生长的肌原纤维的表型，以使其受益。尽管关于哪些应变轮廓导致哪些亚型转换已经有很多发表的信息，但关于这些转换背后的许多机制的实际知识仍然存在显著差距。

然而，已经有关于机械刺激作为肌肉损伤外部治疗效果的报告，触发组织的自我再生能力。研究人员在1991年首次对骨骼肌进行机械刺激的影响进行了研究，他们展示了对兔子的比目鱼肌后肢进行3天的MS的效果。这些后肢通过自制的外部刺激器从兔子身上外科移除。以10赫兹的频率进行的刺激解决了MHC和快肌浆网Ca²⁺ ATP酶蛋白的快速激活，抑制了正常的快肌球蛋白重链和轻链基因，减缓了收缩和松弛特性。这导致mRNA表达更快，增加了产生慢速、I型和快氧化IIA纤维的生产，这些纤维对于增强氧化肌肉能力至关重要。因此，与未刺激的肌肉后肢（对照组）相比，胶原蛋白浓度降低，导致肌肉内增厚的结缔组织，显示出肌节的恢复，表现出更高的抗疲劳能力和更好的功能。

研究人员研究了外部机械刺激对由胶原蛋白/基质胶混合物制造的人类生物人工肌肉（HBAMs）的影响，其中肌肉细胞在分化前培养了最多8天。最初，HBAMs被放置在由2毫米不锈钢针支撑的硅橡胶组织模具上。使用自制的机械细胞刺激器版本4（MCS4）对HBAMs进行拉伸，持续4天，间隔约为每10分钟3.5微米。其中一个针头直接与刺激器接触，以允许传递单向拉伸幅度为25%（破裂前）和速度高达0.5毫米/秒。对静态HBAMs的肌节分析表明，只有2%到10%的横截面积在16天的刺激后形成了肌原纤维，纤维直径小于10微米。与静态系统相比，经过机械刺激的HBAMs在8天的刺激后显示出两到三倍的差异，其中纤维直径增加了12%（从6.4到7.1微米），肌原纤维面积增加了40%。在这项研究中，他们表明定期训练对于肌肉纤维肥大和生长更具弹性的肌肉纤维至关重要，与静态对照组相比。此外，机械调节允许营养物质更快地向细胞扩散，并且与重复机械加载相关的组织重塑更快。

近年来，SMT工程的进步使得功能性体外模型的发展成为可能。其中一种主要的刺激因子是白细胞介素6（IL-6），它对这种效果高度敏感。研究人员指出，IL-6诱导人类皮肤成纤维细胞（NHDF）/C2C12共培养系统的增殖，促进肌原细胞融合，并加速组织的整体成熟。在他们的研究中，使用Flexercell FX-4000张力加系统在真空辅助条件下对Bioflex培养板施加拉伸。Bioflex板拥有一个弹性表面，允许两种细胞（NHDF/C2C12）附着，形成细胞单层，这些单层在不同的拉伸条件下进行了测试：循环短时拉伸（CSDS）（10%应变，卸载率为33%/秒，频率为0.6赫兹，持续8小时），非循环长时拉伸（ALDS）（6%应变，加载率为3%/秒，60秒）以及CSDS和ALDS的组合（8小时的CSDS，随后3小时休息和60秒的ALDS）。非拉伸细胞在分化培养基中用作对照，以表征拉伸装置对肌管形成的影响。为了在拉伸装置内准备共培养系统，成纤维细胞被播种在Bioflex膜上，而肌原细胞则被播种在面向下方成纤维细胞单层的非变形玻璃片上，两者之间相隔2毫米。在共培养系统中，应变仅施加在成纤维细胞上，然而，由成纤维细胞分泌的分化介质的扩散可能影响未受拉伸的玻璃片上的肌原细胞。在共培养系统中，经过96小时后，ALDS随后CSDS显示出增强的肌生成和肌管数量增加了78%，与单独的CSDS相比。与单培养系统（肌原细胞用0-100纳克/毫升IL-6处理）相比，受两种类型循环拉伸（CSDS+ALDS）的共培养系统显示出肌管形成增强；同样，融合效率显著高于仅受ALDS或CSDS条件的细胞。

如前所述，生物材料是制造成功三维细胞构建物的有吸引力的工具，因为它们具有促进细胞粘附的有益特性，并且能够作为多种生长因子的载体。研究表明，尽管水凝胶的力学性能相对较弱，但它们可以在静态和循环条件下轻松拉伸。水凝胶的粘弹性提供了制造可扩展和支持性材料的可能性，用于组织制造。例如，研究人员研究了对封装在核-壳水凝胶微纤维中的小鼠C2C12细胞施加循环拉伸（3%拉伸应变，1赫兹）的效果。C2C12细胞被封装在作为海藻酸盐纤维核心的胶原蛋白凝胶中，这些纤维是使用双同轴层流微流体装置制造的；因此，与典型的静态培养系统（C2C12单层）相比，这种装置导致了更高的肌管长度。他们观察到，使用自制的细胞培养装置对微纤维施加持续刺激，导致细胞活性降低（图13A）。与此相反，封装在水凝胶中的细胞在微纤维下在循环拉伸下成功形成了70%的肌原细胞成熟的肌管结构。细胞骨架染色显示，与培养的单层以及未拉伸的细胞负载微纤维相比，封装在微纤维中的细胞在循环拉伸下显著更对齐（图13B）。

图13.A）用于对封装在核-壳胶原凝胶中的C2C12细胞施加循环拉伸的自制细胞装置。B）荧光图像显示C2C12细胞在水凝胶微纤维中在1赫兹下循环拉伸6天，拉伸应变为3%，与未拉伸的微纤维相比。

这些结果与研究人员的研究一致，他们通过自制的MagneTissue装置对嵌入纤维蛋白凝胶中的肌原细胞施加静态机械应变（10%）进行刺激，持续约10天。他们测试了从最软（10毫克/毫升）到最硬（40毫克/毫升）的不同纤维蛋白浓度，其刚度范围为11.57-17.21千帕。选择了20毫克/毫升的纤维蛋白浓度作为进一步MS的最佳浓度。他们检测到在形成更高数量的成熟肌管，其长度和直径值范围分别为12-15和200-400微米。在机械应变3天后（6小时），细胞嵌入纤维蛋白凝胶中的排列归因于MagneTissue施加的应变传递。此外，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）描绘了在静态应变后MyoD和Myogenin的肌生成表达增加。他们还表明，对单层细胞（二维）施加机械拉伸并未产生类似结果。仅在二维系统中检测到部分排列，与在三维培养系统中获得的增强的mRNA表达、肌节产生和细胞排列结果相比。

研究人员还报告了他们在三维、纤维状细胞构建物上的工作，主要用作生长功能性且有组织的肌肉组织的平台，该平台源自机械刺激的应用。使用硅胶管基凝固浴制造厘米长的细胞负载微纤维，然后可以将其与光交联水凝胶（如GelMA）结合，以形成具有类似组织的微结构的微纤维。通过改变曝光时间，研究人员能够调节水凝胶的机械性质。细胞负载的纤维后来使用嵌入培养系统中的柱状井阵列拉伸装置进行拉伸，以在原位施加不同应变比的单轴拉伸。C2C12肌原细胞显示出在单轴拉伸下改善的扩散、伸长和对齐，细胞在单轴拉伸下的分化也得到了改善。通过将应变比增加到约35%，肌原纤维的收缩性变得更加明显，并达到了饱和水平（图11和图14）。

图14.A）荧光显微镜图像显示成熟肌管中肌节和Z线条纹的均匀分布。肌节的长度通过在右侧图像中手动绘制的白色线测量。左侧白色比例尺为10微米，右侧为5微米。B）在25%、35%、45%应变下肌管的共聚焦图像显示部分条纹图案。白色比例尺为25微米。C）应变比（25%、35%、45%）与微纤维内生长的肌管的肌节长度之间的相关性。D）在电刺激后肌管收缩位移的波形图：顶部为6伏/厘米，2毫秒，不同频率；底部为1赫兹，2毫秒，不同电场强度。与电刺激（ES）相关的参数相关的肌管收缩位移的定量，例如E）频率F）电场强度和G）应变。

已经指出，支架材料（水凝胶、静电纺丝网等）的刚度对于机械刺激至关重要。用于封装细胞的材料必须能够承受多次机械加载，以诱导细胞的形态变化。因此，研究不同技术制造的支架的化学和力学性质在将机械刺激传递给细胞及其响应方面的作用非常重要。

例如，研究人员使用DegraPol嵌段共聚物的静电纺丝支架作为水凝胶的替代品。他们研究了自制生物反应器中的静态和循环刺激对微纤维支架（尺寸为50×5毫米的DegraPol条）的作用，持续13天。在开始动态培养前4天，向样品中额外添加了一批细胞，以提高肌原细胞分化的效率。在初始拉伸阶段，静态和循环条件下均未观察到MHC表达的差异；然而，从第7天起，在静态系统中，与动态拉伸相比，MHC表达减少了36%。此外，光密度分析表明，由于生物反应器内施加的循环拉伸产生的机械效应，在第10天MHC蛋白表达增加了8倍。这种机械效应还通过MHC免疫染色得到证实，其中拉伸条在荧光显微镜下被评估，显示出更密集的纤维阵列和更明确的肌管包。总之，与二维系统相比，三维培养模型中的体外机械刺激可以有效加速工程化肌肉构建物的成熟。

4.2 电刺激

骨骼肌中的运动神经元（MNs）在纤维刺激期间调节细胞膜的去极化，导致适当的收缩反应（力量），这取决于肌肉纤维的大小和健康状态。不幸的是，力量的丧失是骨骼肌疲劳的一个常见问题，其中MNs的频率开始下降（从20到10赫兹），作为响应，骨骼肌显示出收缩能力（收缩）的降低。电刺激（ES）是用于神经刺激的最常用技术之一，以绕过肌肉疲劳。由于电刺激对于骨骼肌的功能至关重要，因此逻辑上要研究电刺激的影响，以及体内提供这种刺激的神经结构的存在，这些结构在肌原纤维中激活类似的调节反馈系统。例如，在新生儿肌肉发育的第一个月，科学家们发现，完整的神经的存在对于新纤维的正常生长和成熟是必要的。成熟的肌肉在体内被神经结构所支配，这些结构为卫星细胞的分化和MHC亚型的转换提供了进一步的刺激。神经肌肉接头（NMJs），即神经元附着在骨骼肌纤维上的地方，提供了发送和接收重要神经递质（如乙酰胆碱）的适当环境。一旦动作电位通过NMJ传播到骨骼肌环境中，一系列离子（如Ca²⁺）就会从各自的储存库中涌入细胞内环境，最终导致肌节的收缩。他们观察到，对C2C12肌肉单层施加电功能场，可以通过反复刺激肌原纤维内的肌动蛋白和肌球蛋白蛋白来影响纤维对电刺激的响应。尽管这种机制与机械转导途径不同，但结果表明，这两种方法对肌原纤维的MHC组成都有一定程度的控制权]。此外，肌肉效率的下降是衰老引起的主要问题之一。肌原纤维尺寸的减小、去神经支配或甚至收缩性问题都是肌肉无力的常见因素。ES已被广泛用作康复技术，以绕过与衰老相关的病理学。例如，研究人员使用自制的电池供电刺激器（I：128±16毫安和V：39±14伏）对少数患者进行电刺激，持续7天，通过在皮肤上放置橡胶电极。从受刺激患者的肌肉活检显示肌肉恢复反应更快。ES可以重新激活重要的标记物（如Serca2、pCamKII），以增加适合的肌原纤维数量，以应对与衰老相关的肌肉无力和疲劳状况。

研究人员展示了经过电刺激的单层细胞表现出内部结构和肌节单位的形成。在刺激细胞中的兴奋-收缩耦合显示出比未刺激细胞更高的Ca²⁺回流，表明成熟度更高。他们在底部涂覆有薄PDMS层（0.1毫米）的氧化铝多孔膜上培养C2C12细胞，形成融合层，上层涂覆有胶原蛋白膜（20微米）。在自制的电刺激器中，他们在氧化铝膜的上方和下方放置了两个铂（Pt）电极，以将电脉冲集中在细胞上，使用幅度：4毫安，持续时间：20毫秒，频率：1赫兹。在胶原蛋白膜上生长的分化肌管具有肌肉组织样的刚度。收缩性肌管还显示出在测量荧光标记的葡萄糖（2-NBDG）的摄取并检测到显著更高的GLUT-4转位后，葡萄糖摄取增加。

此外，研究人员研究了电刺激对体外2D和3D培养系统中肌肉细胞成熟度的影响。他们观察到在C2C12肌肉单层（2D培养系统）上施加电场会导致培养基中营养物质的快速消耗和减少。α-actinin和肌节肌球蛋白的表达在2D对照组中未显示出交叉条纹形成。后来，他们将这些结果从细胞系（C2C12）转化为原代细胞源，即肌肉祖细胞（MPCs），这些细胞被封装在I型胶原蛋白/基质胶水凝胶中，生成3D培养系统。相比之下，在3D系统中使用MPCs制造的生物人工肌肉模型（mBAMs）在3天的ES（4伏/厘米，6毫秒脉冲，频率为2赫兹）后显示出交叉条纹和更高的成熟MHC亚型表达。在48小时的刺激后，显著更高数量的对齐肌管形成，重要的肌肉标记物（如α-actinin、MLP、MYH8和肌节肌球蛋白）的表达上调，确认了肌节单位的形成和更高收缩性。

此外，3D细胞培养系统已被用于各种研究中，以评估电刺激。例如，研究人员研究了直接电刺激如何导致人类肌肉细胞快速消耗氧气。他们在PDMS模具中的基质胶/纤维蛋白凝胶上播种人类肌原细胞，并使用Oxygraph-O2呼吸仪研究刺激前后肌肉束的线粒体呼吸功能。在分化后，将肌肉束转移到自制的微生理流动室中，并使用碳平板电极（40伏/厘米，抽搐：1赫兹，持续时间：10毫秒和强直：20赫兹，1秒）进行电刺激。在这种刺激下，肌肉束的呼吸倾向于增加；然而，基质胶显著影响了收缩性肌肉束中的氧气消耗。此外，他们研究了在凝胶中封装的人类骨骼肌细胞在电刺激（ES）30分钟后，当没有基质提供时，氧气运输增加了20倍。继续研究生物材料在减少电场对人类肌原细胞的副作用中的作用，研究人员研究了在Matrigel中形成肌束（iSKM）以及间歇性电刺激（1-10赫兹，70毫安幅度和2毫秒持续时间）对肌管成熟率的影响。在分化后，使用LabVIEW程序在自制的PDMS室中在分化后的第1周和第2周之间持续进行ES。免疫染色显示，与未刺激的对照组和未刺激的3D肌束相比，模拟的3D肌束中的细胞核数量增加了1.5倍。此外，肌束的横截面积增加了1.8倍。此外，抗肌萎缩蛋白/细胞核染色显示出由于电刺激的持续效应，肌管长度增加，导致肌节组织更好。西方印迹通过显示出比2D对照组和未刺激的肌束更高的肌节蛋白（如抗肌萎缩蛋白和MHC）表达来确认结果。在ES触发的持续强直收缩后，通过测量糖酵解代谢来研究细胞的疲劳性。葡萄糖转运蛋白表达的增加证实了与未刺激的肌束相比，疲劳抵抗力降低。

另一项对成熟肌肉组织的评估涉及测量从骨骼肌细胞中释放的肌因子，这些细胞通过外部电极系统进行电刺激（图15A）。研究人员表明，肌因子作为专门的细胞因子，负责调节体内葡萄糖水平和受伤肌肉的重塑反应，在ES下增加。将封装的C2C12肌肉细胞在胶原蛋白和基质胶中培养在聚(3,4-乙烯二氧噻吩)/聚氨酯（PEDOT/PU）导电线膜（3微米厚度）周围，并使用非法拉第ES进行刺激，使用充放电电流（5毫安幅度，10毫秒持续时间，50微库仑电荷）。SEM图像显示细胞围绕导电线的早期排列，并且在培养3天后未检测到毒性（图15B）。在分化7天后，肌管显示出在低频率（1和5赫兹）下的抽搐收缩行为和在高频率（10和20赫兹）下的强直收缩（图15C）。缺乏细胞脱落不仅证明了远达电刺激未对细胞造成显著损伤，还增强了它们的肌节成熟度，与使用外部电极的传统系统相比。

图15.ES刺激接近3D肌肉样系统。A）内部和外部电极系统用于激发由肌束层包裹的PEDOT/PU导电膜组成的骨骼肌束，B）导电膜的SEM图像，C）肌管围绕导线的收缩响应位移与施加电脉冲的持续时间。

总之，ES可以触发肌肉细胞正常收缩功能的部分恢复，但在肌肉组织的完全重塑和功能化方面仍缺乏适当的控制。肌管的收缩性高度受到所用支架的刚度和力学性质的影响。然而，ES仍然面临刺激如何沿支架传递并到达细胞的问题，导致MHC表达受到抑制，肌原细胞分化减少。

4.3 磁刺激

作为一种替代传统电刺激的方法，磁刺激被提出，因为它是一种侵入性较小的方法。它仍然可以深入肌肉并刺激它，通过产生肌肉细胞膜的去极化，这对于有效调节细胞施加的收缩力强度至关重要。最初，磁刺激被提出用于神经系统刺激或治疗尿失禁。然而，少数研究表明其在骨骼肌再生中的潜在应用，这是由于恒定磁脉冲产生的抽搐力减少。尽管其潜力巨大，但关于磁场如何刺激这些细胞，从而触发肌肉修复的机制尚未在体外模型中深入研究，因为大多数研究都集中在促进小鼠和人类模型中的康复。例如，研究人员测试了直接磁场对C57小鼠股四头肌横断伤的影响，使用Biocon 2000 W。将动物的股四头肌置于磁刺激器的线圈中，并在10分钟内进行20分钟的会话，其中10分钟为10赫兹，10分钟为50赫兹。非刺激动物被用作对照组，以表征肌肉修复的程度。在刺激5天后，从股四头肌中取出的组织显示出更快的修复，表现为再生组织的横截面，与非刺激样本相比。非刺激对照组显示出由于缺乏磁刺激促进的肥大而出现萎缩肌肉。肌肉的免疫染色显示出与对照组相比更高的MHC表达，西方印迹证实了先前的结果，显示出与非刺激组织相比3倍增加的MyH1。此外，磁场显示出改善肌肉收缩的能力，这是由于刺激产生的再神经支配效应。在磁刺激下，与对照组相比，刺激组织中NMJ的形成增加了3倍。这一观察结果证实了磁刺激作为肌肉损伤治疗以及肌肉衰竭期间神经再生的潜在应用。

磁刺激还被应用于SMT工程中，以研究其在体外模型中的2D或3D培养系统中的影响。然而，将直接磁场应用于不同类型的细胞的一个主要缺点是，由于磁场强度（1-10 T）的增加，可能会产生细胞生长异常（癌症）的可能性。例如，研究人员研究了使用静态磁场（SMF）对L6骨骼肌细胞的2D培养的影响。最初，细胞培养1天并分化4天。SMF暴露在细胞播种后立即开始，并持续整个实验过程。使用定制设备在细胞单层上施加80毫特斯拉的磁刺激，而对照系统在没有刺激的情况下培养了5天。经过肌动蛋白/细胞核染色后，在对照组中检测到排列和有组织的肌动蛋白丝，65%±3.6%的细胞成功融合并形成肌管。研究人员还研究了约80±5毫特斯拉的SMF对肌原细胞/间充质干细胞共培养系统的影响。在这项研究中，未检测到Myf5标记水平的差异。

强SMFs经常被讨论，因为它们有可能帮助指导肌丝的取向。研究人员使用41.7 T/m的磁梯度和10 T的通量密度对分化的C2C12肌原细胞进行磁刺激，以评估引导肌管取向所需的最小场强。结果表明，在6天的分化和磁刺激后，C2C12细胞显示出对时间的正增殖反应，肌原细胞成功形成了紧密排列且对齐的结构。当磁场应用于生物材料时，会产生扭矩力（抗磁各向异性），这对于对齐分化的肌管中的肌动蛋白至关重要，从而增加了它们的长度。这些结果表明，最高的磁梯度（41.7 T/m）和密度（10 T）与最低测试密度（3 T）相比，显著改善了肌管的取向，后者仅提供了适度的通量且未产生抗磁各向异性。此外，通过肌球蛋白重链（MHC）的免疫染色研究了刺激和未刺激细胞的分化和增殖特性。结果表明，尽管刺激细胞的MHC含量略有增加，但与对照组相比差异不显著。此外，未检测到细胞活性的差异，表明磁场未对研究的2D模型产生任何可观察到的凋亡效应。

关于磁场在3D模型上的应用的有限研究也已有报道。例如，研究人员报告了通过在外部磁场下对自制造的细胞负载水凝胶（μMACs）施加非机械致动的应用。通过开发一个由聚甲基丙烯酸甲酯组成的模具系统来制造μMACs。随后，使用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层覆盖模具的底部，而顶部则用光掩模覆盖。为了在构建体中诱导磁致动，作者在涂覆有聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）/Fe₃O₄颗粒的模具上施加了不同应变（10%、20%、40%和60%）。最后，将含有C2C12细胞的不同浓度（10%、15%和20% w/v）的GelMA溶液滴加到磁性层上。作为对照系统，仅包含5% w/v Fe₃O₄纳米颗粒的10% w/v PEGDMA球体在相同的磁场下进行了处理（图16A）。随后，在6小时的封装后，肌肉样构建体和对照组每天磁刺激10小时，持续10天（图16B）。在10% GelMA/PEGDMA磁性水凝胶中分化10天后，结果表明，在应变为40%的细胞负载构建体中成功成熟和对齐了肌管。相比之下，在应变为60%的构建体中只有少量分化的肌管，而在应变为20%的构建体中根本没有肌管发育（图16C）。此外，在应变为40%的3D构建体中，转录调节因子（如MHyC）的mRNA水平约为0.1，与应变为20%（约为0.01）和60%（约为0.025）的μMACs相比。结果表明，更高的磁应变（40%和60%）可以增强分化的肌管的成熟。然而，为了适当地构建紧密排列的健康肌管阵列，40%的应变被确定为最佳条件，以提供适当的外部线索。这些线索被认为能够触发封装细胞所需的力学生物学特性。

图16.磁刺激接近3D肌肉样系统。A）将氧化铁纳米颗粒悬浮在GelMA基质中，B）随后置于外部磁场中。磁性颗粒沿着磁场线形成各向异性线条C），可以进行生物打印D）和交联E），以形成所需的基底。

研究人员在中发表了关于磁场对SMT工程构建体有益影响的另一项研究。他们在含有磁性脂质体（MCLs）的培养基中培养C2C12细胞8小时，以诱导细胞摄取MCLs（每个细胞100皮克）。随后，将标记有MCL的细胞播种在24孔板的壁和固定聚碳酸酯圆柱（直径12毫米）之间的环形间隙中，圆柱形钕磁铁（30毫米×15毫米）提供外部磁场。在2天的培养后，形成了环形细胞结构，随后在细胞上倒入0.1毫升的ECM溶液（I型胶原蛋白/基质胶）。在进一步培养4小时后，将环形细胞结构放置在35毫米培养皿中的两个不锈钢针上，以通过静态应变促进对齐，并通过添加分化培养基诱导肌生成。此外，将两个碳电极放置在培养皿的两侧，并使用电脉冲（15伏，10毫秒）施加0.4特斯拉的磁感应，持续约20天。组织学分析表明，MCL颗粒的含量并未影响3D环形构建体的细胞活性，保持了在磁刺激期间构建体的稳定性。此外，未标记MCL的对照样本显示出细胞片状结构围绕磁铁形成，这是由于磁力导致对照细胞从ECM中脱落。在实验结束时，MCL标记的细胞上出现了清晰的肌纤维形成，它们在圆柱形结构内平行排列。

大多数已进行的研究表明，在2D系统中，至少需要约10特斯拉的最小磁通量密度才能促进肌纤维的分化和随后的对齐。然而，α-actinin、F-actin和细胞核染色显示出肌节在对齐的肌管内形成，表明低磁场（0.4特斯拉）通过材料的分布导致刺激细胞的有益结果。事实上，磁刺激在发育的3D肌管上触发的收缩反应证实了探索新的外部刺激替代方案的重要性。总之，磁场是成功再生骨骼肌的强大工具，适用于体外和体内模型，尤其是作为电刺激的非侵入性替代方案。迄今为止，尚未有关于细胞在不同磁场暴露后DNA损伤的报告，而这里回顾的技术都显著提高了各种肌纤维的增殖和分化能力。然而，这种磁场如何影响肌肉内的神经反应的实际机制，以及随后如何影响自我再生过程，仍在研究之中。表1总结了机械、电和磁刺激骨骼肌细胞的重要参数和获得的结果。

表1. 机械、电和磁刺激的重要参数和获得结果的概述。

4.4 化学刺激

近年来，研究人员试图通过化学刺激来剖析骨骼肌增殖和分化的复杂机制。虽然一般的化学途径和组成这些途径的蛋白质已被确定，但关于这些途径如何自我调节以及相互调节的知识仍然缺乏。此外，许多化学技术已被用于探索特定已知的信号通路。研究人员可以进一步阐明每个途径对骨骼肌细胞的肌生成行为的贡献。本节将重点关注使用生长因子或其他化学刺激剂激活维持关键SMT功能的强健调节通路的研究，无论是通过增加肌原细胞的增殖还是通过扩大组织工程结构中的肌纤维直径。

许多研究评估了生长因子对肌原细胞和分化的肌管的影响。生长因子是影响身体大多数组织的信号分子。在SMT中，不同类型的生长因子在骨骼肌发育的不同阶段出现，如胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）、肝细胞生长因子（HGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）。这些生长因子中的每一种都可以有多种亚型，对骨骼肌分化产生独特的影响。例如，FGF-19已被证明可以引起重要的肌肉肥大以及增加功能性能力，而FGF-21被发现对骨骼肌细胞的增殖或分化没有直接影响。关于生长因子及其对肌肉分化的影响的大部分工作已在其他地方进行了综述。

生长因子和蛋白多糖，如agrin，也对SMT工程具有吸引力，因为它们能够激活已知调节成熟、功能性肌管发育的信号级联反应。特别是IGF-1已被广泛认为是促进肌原细胞分化和分化的肌管肥大的促进剂。近年来，IGF-1的确切机制已被证实通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号通路起作用。这两个通路对于在体内外成功开发功能性肌管至关重要，突出了IGF-1作为治疗的一部分的潜在重要性。其他疗法包括在3D生物工程人工肌肉（BAMs）中使用agrin，以尝试在分化的肌管周围形成成熟的乙酰胆碱受体（AChRs）。这些BAMs是通过在两个硅胶柱之间培养绿色荧光蛋白转导的CH3小鼠肌原细胞构建的，允许形成对齐的3D组织。在14天的培养后，研究人员将6微升1单位/毫升的agrin置于分化培养基中。文献中指出agrin对肌纤维中AChR聚集有积极影响，这是成熟、功能性肌纤维的一个重要物理特征。agrin处理导致BAM中AChR聚集增加了7.3倍，然而这些AChRs在大小和形态上都不成熟。同样，BAM中的MHC亚型主要是围产期和胚胎期的。始终存在的问题——肌纤维表型的不成熟——需要更多的工作来解决，而不是这些实验所提供的。

胰岛素样生长因子，包括IGF-1，是肽类生长激素，它们在胚胎发育的后期阶段以及受损肌纤维的修复过程中协助形成成熟的肌管。最近的研究发现，IGF-1和HGF通过p38 MAPK和PI3K通路激活卫星细胞以修复受损肌肉，而每天注射重组FGF-19持续7天已被发现促进成年小鼠模型中细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化。ERK1/2是另一个重要的级联机制的一部分，它可以促进卫星细胞的增殖或分化为肌管，具体取决于通路激活的持续时间有多长。这些通路的复杂性近年来已逐渐揭示，允许尝试对体内外的疾病和萎缩肌肉模型进行更有针对性的治疗。

生长因子以不同的方式影响关键MRFs的表达，这在考虑在特定疗法中包含哪些生长因子时非常重要。虽然FGF-19促进了成年小鼠模型中卫星细胞群体的激活并诱导肥大，但它对各种MRFs的表达没有影响；HGF和PDGF也是如此。然而，IGFBP-6能够上调儿科间充质干细胞（PMSCs）中的MyoD、Myogenin和总MHC水平，而IGF-1同样被证实可以增加MHC和肌钙蛋白的表达，从而产生更成熟的肌纤维。通过利用这些生长因子，研究人员可以利用身体的自然信号通路来协助组织工程方法。

除了生长因子外，研究人员还使用了其他疗法，这些疗法受到自然骨骼肌发育和维持过程中使用的不同化学物质的启发，以潜在地建立一系列单一技术的组合。尽管这些技术在个体治疗潜力上相对有限，但可以联合使用，以产生显著的效果。研究人员已经评估了特定化学物质在各种自然过程中已经使用的影响，例如钙、甲状腺激素和胆碱对肌肉发育的影响。在过去二十年中，通过使用β-肾上腺素受体，特别是骨骼肌中的β2-肾上腺素受体，成功增加了年轻和老年小鼠模型的肌肉质量。β-肾上腺素受体是一种特定类型的G蛋白偶联受体，它在体内的多种信号通路中发挥作用。在骨骼肌中，最常见的β-肾上腺素受体亚型是β2-肾上腺素受体。β2-肾上腺素受体使用G蛋白激活PI3K-Akt信号通路，该通路利用其他蛋白质和信号分子的组合来激活mTOR和其他转录因子。之前，这种亚型已通过化学物质（如芬特罗林）激活，这是一种β2-肾上腺素受体激动剂，由于所需的暴露时间较长，会产生不幸的蛋白质降解副作用以及离靶效应]。研究人员能够通过使用重组腺相关病毒载体（rAAV）进行β2-肾上腺素受体基因递送，绕过使用这些激动剂及其副作用。通过单次注射1×10¹⁰个rAAV：β2-肾上腺素受体基因组，作者能够在成年小鼠的胫骨前肌中诱导肌肉质量增加22%，这一效果在整个84天的实验期间得以维持；这相当于通过28天的重复福莫特罗治疗所看到的肌肉质量增加。

一些研究人员通过改变体外标准培养程序显著改善了肌肉分化，而另一些研究人员则尝试改变已知诱导肌肉萎缩的诱导剂的剂量，以促进肌管形成。尽管分化培养基的传统金标准含有25毫米的葡萄糖和链霉素，但Khodabukus和Barr报告了将葡萄糖水平降低到10毫米并去除链霉素对肌肉发育的影响。他们发现，在补充有链霉素的10毫米葡萄糖水平下，总MHC降低，与传统25毫米葡萄糖的对照培养基相比。然而，MyoD水平在葡萄糖降低的条件下更高，而Myogenin在传统高葡萄糖条件下表达更多，而Myf5和MHC亚型在任何组中均无显著差异。事实上，链霉素已被发现会降低生物工程C2C12构建体中的力产生，因为它会导致快速到慢的SERCA亚型转换。结合链霉素作为肌细胞的钙阻滞剂的能力，这创造了一个难以考虑在实验中包含链霉素而不考虑这些特征的叙述。

同样，研究了地塞米松（DEX）的剂量对C2C12小鼠肌原细胞分化的影响，因为DEX在高剂量下已知会诱导肌肉萎缩。免疫细胞化学分析显示，在肌培养的第6天，用10毫摩尔DEX处理的样本中形成了肌节，而在没有DEX的对照组中几乎没有肌节形成。

4.5 生物刺激

在SMT工程中，为了更多地了解肌原细胞成功分化为成熟、功能性肌管所需的精确刺激，尝试使用尽可能多的工具变得非常重要。在体内，分化的肌原细胞从其周围的细胞环境中获取大量信息；这些信息来自构成该环境的细胞类型以及它们分泌到细胞外基质（ECM）中的物质。通过将不同类型的细胞（如成纤维细胞或运动神经元）纳入骨骼肌刺激方法中，研究人员能够推测这些细胞对肌原细胞的增殖和分化产生的影响。例如，成纤维细胞在体内主要起支持作用，包括在SMT中。由于它们在损伤后经常分泌的胶原蛋白等基质材料，它们一直是组织工程师的研究目标。成纤维细胞和肌原细胞的体外共培养并不是一个新概念，因为它们在过去几十年中在创建2D和3D肌肉类器官方面取得了成功。然而，近年来，它们在功能性SMT开发中的作用由于关键共培养研究的持续进行而得到了进一步阐明。

在肌肉损伤后的修复过程中，伤口部位通常充满了各种细胞，包括巨噬细胞、成纤维细胞和再生性卫星细胞。如果将这些细胞一起培养，它们对肌原细胞的迁移和增殖有显著影响，正如研究人员所报告的那样。他们的实验比较了三种实验组的肌原细胞的增殖和迁移效应：肌原细胞/巨噬细胞共培养、肌原细胞/成纤维细胞共培养以及包含所有三种细胞类型的三重共培养。在单独的共培养中，成纤维细胞可以促进肌原细胞的迁移，而巨噬细胞只能促进它们的增殖。具体来说，在肌原细胞/成纤维细胞共培养中观察到的促进迁移效应在三重共培养中无法复制，表明这种特定反应以某种方式被巨噬细胞的存在所抑制。这些反应的确切机制至今尚未明确。

肌原细胞不仅受到其他细胞类型的影响，而且它们自身也被证明具有影响力。研究人员对早期肥大模型中的成纤维细胞和肌原细胞进行了体内分析。他们的结果表明，肌原细胞的早期存在可以减少成纤维细胞产生的纤维性胶原蛋白的数量，即使这些肌原细胞只存在很短的时间。如果目标是用功能性成年肌原纤维替换和修复受损的肌纤维，那么组织工程师必须专注于减少和预防纤维化的技术，就像他们专注于促进健康的肌生成技术一样。然而，研究人员指出，与单培养以及肌原细胞/成纤维细胞共培养相比，肌原细胞/肌成纤维细胞共培养产生的肌管明显更厚且更具有多核性。这种更成熟的形态表型表明，与单培养相比，肌成纤维细胞在共同培养时显著促进了肌原细胞的分化。

为了为骨骼肌的功能提供所需的能量，需要一个高度整合的血管系统。血管细胞，如内皮细胞，与卫星细胞、肌原细胞和肌管之间有着密切的关系。在体内外的大规模工程化肌肉组织中，缺乏血管网络经常导致坏死和组织失败。因此，缺乏血管系统时氧气和其他营养物质的扩散限制是体外骨骼肌开发以及整个组织工程领域的一个最重要的障碍。血管生成，即组织的血管化，是一个复杂且多方面的过程，超出了本综述的范围；然而，将内皮细胞纳入肌原细胞的共培养中是骨骼肌组织工程的一个不断发展部分，应该在此处进行讨论。

关于内皮细胞和肌生成前体细胞在它们的协同对话中利用的确切交叉信号通路的知识，不幸的是，目前还很缺乏。数十年来，研究人员已经知道，内皮细胞和肌肉卫星细胞之间的联系超出了它们的紧密空间接近性；这两种细胞类型相互协调，以促进彼此的迁移、增殖和分化。近年来，这些细胞在体外被重新引入，以进一步研究这种协调可以达到什么程度。研究人员在2015年引入了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）到他们的BAM模型中，试图预血管化他们的肌肉构建体。他们的结果表明，人肌细胞与HUVECs的比例为70:30或60:40，比简单的50:50比例更能显著促进肌纤维的增殖和排列。然而，这些肌纤维是在内皮细胞生长培养基（EGM）中培养的，以维持两种细胞群，避免细胞死亡过多。这些肌纤维在共培养7天后没有显示出任何横纹，这可能是由于缺乏肌肉特异性生长或分化培养基，或者是由于培养时间较短。研究人员研究了内皮细胞条件培养基是否可能在与人肌原细胞共培养时携带一些它们的好处。他们2017年的研究发现，内皮细胞条件培养基促进了人肌原细胞的增殖和肌生成素表达；然而，除了肌生成素外，没有分析其他MRFs，且最终肌纤维的成熟度尚不清楚。

由于肌纤维对电刺激的固有依赖性，运动神经元（MNs）也被确定为骨骼肌发育中的一个重要生物因素。特别是从腹侧脊髓中提取的运动神经元在与骨骼肌肌原细胞的共培养中有着成功的过往。随着运动神经元附着在肌原纤维上，它们形成了神经肌肉接头（NMJs），这些接头已在体外的3D共培养实验中成功形成，并随后用于通过化学和电学方式刺激肌原纤维。不幸的是，这些刺激方法通常会产生表型不成熟的肌原纤维，因为运动神经元和肌原细胞之间形成的神经网络未能提供足够的刺激以促进成熟的肌生成分化。研究人员通过一系列实验研究了这一点，他们在3D纤维蛋白/Geltrex水凝胶中培养了运动神经元簇，并在其中播种了人肌生成前体细胞和人成纤维细胞样细胞系。经过两周的培养，3D水凝胶环境促进了更厚、更功能性肌管的形成，以及从运动神经元簇中更大的神经突再生，超过了2D对照组。这种三重共培养为对齐肌管的形成提供了最佳环境，并检测到神经突再生进入AChRs；然而，没有关于特定MHC亚型的数据，因此尚不清楚共培养是否产生了具有成熟表型的肌管。

虽然传统的共培养方法涉及细胞与细胞之间的接触，但微流控装置的出现使得研究人员可以在保留共培养两种不同类型细胞的好处的同时，为细胞群体提供一定程度的分离，模拟体内环境。研究人员报告了这样一种微流控装置的开发，该装置使用传统的C2C12肌原细胞以及经过基因编辑的对光刺激敏感的运动神经元。通过在装置的一个孔中光刺激运动神经元，研究人员观察到另一个孔中的肌纤维出现了收缩性抽搐反应。免疫染色证实了横纹肌节结构的存在，这些结构可能是由刺激性神经网络的存在和增强所促进的。研究人员进行了类似的微流控神经肌肉共培养研究，并发现与非神经支配的纤维相比，神经支配的肌管的收缩行为显著更强且更频繁。

监测肌纤维对神经网络刺激的Ca²⁺通量反应对于剖析运动神经元对肌纤维表型决定的影响变得越来越重要。研究人员发表了一种方法，通过在大鼠模型中植入背侧窗口来实时分析这些通量。他们将分化和未分化的骨骼肌构建体植入背侧皮肤褶皱窗口，并引入了可通过窗口测量的细胞内Ca²⁺传感器。植入后分析表明，预先分化的肌纤维比未分化的样本产生了更大的肌纤维。它们随后更高的力产生能力归因于增加的Ca²⁺通量，以及宿主中新生血管的生长。

五、展望

近年来，制造和开发技术的进步使得形成更复杂的人类骨骼肌模型成为可能，这些模型在功能和生理细微差别上与天然组织更为相似。这些开发模型的多细胞结构应用范围从更准确地模拟疾病到为VML生成用于移植的组织。通过应用各种加载或电脉冲来模拟体内条件，以及与支持细胞共培养，可以进一步促进组织的成熟。然而，该领域仍处于起步阶段，关于材料、调节因子和细胞对肌肉成熟过程的组合效应仍有待解答，以形成更具代表性的人类组织模型。

未来的研究需要面对肌肉组织在移植后如何与天然组织连接的问题。正如本综述所示，取得的进展大多集中在改善体外生长组织的功能上。对于像移植这样的医学应用，还有更多的因素需要考虑。此外，为了避免组织坏死，为体外生长的肌肉组织提供营养和氧气至关重要，这可以通过在植入前进行血管化来实现。尽管迄今为止已经做出了努力，但尚未建立天然组织和植入组织之间的永久连接。同样，将天然神经系统与移植组织连接起来对于实现天然和移植组织的同步收缩以及功能至关重要。尽管研究显示在共培养骨骼肌细胞和神经细胞方面取得了进展，但这一问题尚未得到解决。

如上所述，SMT工程领域在过去10年中取得了巨大发展，朝着创造越来越复杂和生物模拟组织的方向前进。在接下来的10年中，我们相信功能性SMT研究将集中在四个主要差距上。i）生产具有类似天然组织的功能和收缩诱导力的多细胞组织。重新设计组合刺激和共培养平台将导致组织结构的成熟。ii）开发工程化组织血管化的策略，以促进营养物质、氧气和可溶性因子向细胞的运输，从而促进更大规模工程化骨骼肌构建物的形成。iii）模拟多组织和多器官构建物。多谱系类器官的发展能够自我组装，极大地增加了形成具有与人类肌肉组织相似复杂性的多细胞结构的潜力。iv）推进SMT模型在药物筛选目的中的应用，这比心脏和其他组织的进展要慢。将研究结果转化为商业制造和广泛临床应用还存在进一步的挑战，包括实现规模化、可重复性和监管批准。

除了本文主要关注的医学应用外，生长骨骼肌组织也吸引了其他行业，特别是制药和食品行业的兴趣。生物模拟工程化组织为高通量和个性化的药物筛选提供了机会，减少了对动物实验的需求，加速了药物向临床的成功转化，并优化了患者结果。随着骨骼肌组织工程的不断发展，并纳入生物学上有意义的刺激，可以预见的是，药物反应的体外-体内相关性可能会得到改善，工程化组织有可能减少并最终可能取代动物实验。像Cytokinetics、Sarpeta Therapeutics和Solid Biosciences这样的公司正在开发针对疾病和患者特定药物的方法。重点不仅在于开发遗传和医学方法，还在于开发针对最常见的肌肉和神经肌肉疾病的设备。

此外，全球对蛋白质基食品的需求正在迅速增长，肌肉组织工程作为人造肉的来源正吸引着越来越多的关注。在实验室中生产人造肉替代品是一个新兴行业，旨在提供比传统畜牧业更符合伦理的选择。生产人造肉的重要性不仅源于对动物源蛋白质需求的大幅增加，还源于动物农业对环境的影响——仅在美国，动物农业就占温室气体排放量的约10%，全球甲烷排放量的37%。人造肉一词可以指各种来源的肉类，如植物基肉类替代品（豆腐、小麦肉或天贝）、真菌（例如，Quorn真菌蛋白产品）、细胞基肉类和转基因动物肉类。细胞基肉类在遗传上与传统动物肉类完全相同；然而，由于其结构复杂性，开发起来非常困难。因此，人们努力通过在共培养、不同基底和生物反应器系统中生长不同类型的细胞来模仿动物肉类的口感和质地。例如，肌卫星细胞或脂肪干细胞可以在生物反应器中在动物体外的生长培养基中生长。这些是多能细胞，可以分化，但需要定期重新收获。此外，模仿天然肉类的质地仍然是一个挑战，这直接且强烈地影响产品的口感和口感。事实上，复制碎肉比复制牛排要简单得多。正在研究培养中的刺激作为一种潜在的手段来解决这一挑战。2013年，Mosa Meat的首席科学家Mark Post教授首次报告了一种实验室培养的无屠宰汉堡，当时其成本约为25万欧元。然而，该领域仍然存在重大障碍，因为仍然需要使用动物作为细胞的初始来源，动物源性血清是细胞增殖和分化培养基的基本成分，难以且昂贵地替代。此外，这一选择可能无法满足素食者和纯素食者的需求，而且通过这些方法获得的肉类数量还无法满足全球市场的需求。

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